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HiFi One-Step RT-PCR Mix
| 本试剂采用稳定高效的RT-PCR预混体系，是以RNA为模板进行一步法RT-PCR的专用试剂。其原理为用基因特异性引物进行反转录反应，获得第一链cDNA（不可使用Oligo（dT）或Random Rimer合成第一链cDNA），再使用基因特异性正向引物和反向引物进行PCR扩增，在同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部过程。反应体系中已含有电泳所需的指试剂（蓝色和黄色），反应后可以直接进行电泳。 在本试剂中，将耐热M-MLV反转录酶、Rnase Inhibitor、Hotstart高保真DNA聚合酶以及稳定剂等配制成50×One-Step Enzyme Mix预混液；反应Buffer、dNTP以及电泳指示染料配制成5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此使得操作更加简单便，扩增产物可用于平端克隆和DNA测序。 | ||
组分 | ||
| 组分名称250T50×One-Step Enzyme Mix100 μl5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer1 mlRNase Free H2O1 ml×3 | ||
| 注意：1.50×One-Step Enzyme Mix粘度高，第一次使用之前要离心收集至反应管底部，吸取时应缓慢小心。 2.由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶，反应配制可在常温进行，但各组分应-20°C保存。 | ||
主要特征 | ||
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储存 | ||
| 请置于-20°C，可保存2年；避免反复冻融。 | ||
实例 | ||
| 1.以Hela细胞总RNA为模板，使用HiFi One Step RT PCR Mix扩增不同长度的目的片段。电泳结果显示，166bp～4128bp 的 DNA 片段都得到了良好的扩增。 | ||
| 基因名称模板使用量gDNA：500bp、2kb、5kb、8kb、12kb≤2kb 50ng2kb~8kb 100ng＞8kb 200ngλDNA：500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb50 ngHela cDNA：166bp、552bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp≤2kb 相当mRNA 50ng＞2kb 相当mRNA 200ng | ||
| >1000 bp1000~3000 bp>3000 bp55°C，10min55°C，10min55°C，10min95°C，2min95°C，2min95°C，2min95°C，20s58°C，20s72°C，30s32cycles95°C，20s58°C，20s72°C，1min20s32cycles95°C，20s58°C，20s72°C，2min 5s32cycles72°C，2min72°C，2min72°C，2min | ||
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M：D10000 DNA Marker，1-7分别为：β-actin(166bp)、GAPDH (552bp)、GAPDH(960bp)、BMP2 (1574bp)、PRKN (1705bp)、TFRC (2755bp)和TFRC( 4128bp)。 | ||
| 2. 以Hela细胞总RNA为模板，使用不同的RNA模板量（1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg）进行HiFi One Step RT PCR Mix扩增。电泳结果显示，三种不同长度的片段都获得良好的扩增，过多的模板可能会抑制扩增。 | ||
| 960bp1574bp4128bp55°C，10min55°C，10min55°C，10min95°C，2min95°C，2min95°C，2min95°C，20s58°C，20s72°C，30s32cycles95°C，20s58°C，20s72°C，1min20s32cycles95°C，20s58°C，20s72°C，2min 5s32cycles72°C，2min72°C，2min72°C，2min | ||
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| M：D10000 DNA Marker，1-9分别为1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg的 RNA模板扩增产物 |