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南极热敏UDG
| 热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG。该热敏UDG酶能有效地水解单链或双链 DNA 上的尿嘧啶，产生的缺嘧啶位点，在高温或高 pH 下，极易水解断裂。该酶对RNA无活性，主要用于PCR扩增产物的防污染。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。而来源于嗜冷海洋细菌的热敏UDG在50℃ 5min即完全失活，在进行PCR扩增前，在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶（热敏性），25℃10min即可消除PCR产物的残留污染，由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶（热敏性）在PCR循环的94℃变性一步便可被灭活，因此不会影响新的含dU的PCR产物。 | ||
组分 | ||
| 组分名称数量abile Uracil DNA Glycosylase(1 U/μl)100 μl/500 μl | ||
应用 | ||
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活性定义 | ||
| 在标准反应体系下，37°C每分钟催化 60 pmol 尿嘧啶从含尿嘧啶的双链 DNA 上释放所需要的酶量为一个活性单位。 | ||
反应buffer | ||
| Heatlabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)与绝大多数的PCR 聚合酶反应缓冲液都是兼容的，但在高离子浓度(>100mM)下活性会受到抑制。 | ||
酶保存液 | ||
| 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。 | ||
储存 | ||
| -20℃可保存2年，避免反复冻融。 | ||
热失活 | ||
| 50℃，10min。 | ||
实例 | ||
| 为评估热敏UDG对残留模板去除的能力，我们首先使用含dUTP的RAPA3G Probe qPCR MasterMix扩增三种基因产物（GAPDH,EHP,Covid-19 N Gene），然后以105拷贝的含U产物作为模板，分别加入0.1U/reaction、0.25U/reaction、0.5U/reaction和1U/reaction 的热敏UDG(C5029)进行qPCR，程序如下： 25℃ 2min, 95℃ 5min 95℃ 5s 60℃ 30s 45cycles 25℃孵育2min使UDG发挥活性，降解含U产物，以降低其产生假阳性信号的机会；统计三组加热敏UDG和不加UDG组反应的Ct值（如下表），得到△Ct，△Ct值越大说明去除残留产物的效率越高。本实验说明：0.1U/反应的该热敏UDG即可很好的降解含U产物（如下图），即具有良好的去除残留模板的能力。 | ||
| 热敏 UDG（C5029）GAPDH Ave.CtEHP Ave.CtCovid-19 N Gene Ave.Ct019.519.621.30.1 U/reaction34.836.837.90.25U/reaction37.339.938.20.5 U/reaction3536.938.91 U/reaction36.639.539.3 | ||
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