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BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit) YB7902B

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BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit) 

试剂盒组分:

组分YB7902B
BCA 试剂 A  100mL
BCA 试剂 B 3mL
BSA 标准品(5mg/ml1mL

工作原理:

碱性条件下,蛋白将二价 Cu 离子还原为一价 Cu 离子,一价 Cu 离子与 BCA试剂形成紫颜色的络合物,吸光度强度与蛋白浓度程正比。测定其在 562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算出待测液体的蛋白浓度。

试剂盒性能:

  1. 准确灵敏,线性范围广,BCA 试剂的蛋白测定范围是 20-2000ug/ml;

  2. 快速:45 分钟内完成测定;

  3. 经济实用:在微孔板中进行测定,可大大节约样品和试剂用量;

  4. 稳定:不受样品中离子型和非离子性去污剂影响;

  5. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

注意事项:

  1. 低温或长期保存,若发现 BCA 试剂中 A 或者 B 试剂有沉淀发生,请于 37°C恒温并搅拌促使其充分溶解,若发现细菌污染(如出现不可溶解的絮状物或沉淀)则应丢弃,避免对实验结果造成影响;

  2. 不受大部分样品中的化学物质的影响,可以兼容样品中 5%的 SDS,5%的Triton X-100,5%的 Tween 20/60/80 等;

  3. 每次测量蛋白浓度均应做标准曲线;

  4. 当试剂 A 或者 B 混合时出现浑浊,请充分混匀,浑浊即会消失;

  5. 需准备 37°C水浴或恒温箱、酶标仪或普通分光光度计,测定波长为 562nm(540-595nm 之间皆可);

  6. 使用 BCA 蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深,并且显色反应的速度和温度有关,因此需要注意检测时需要保持定时和定温,以确保测量数值的精确;(37°C 30min/室温 2h)

  7. 实验操作规范,提高上样量的精确度。

使用方法:

  1. 配制 BSA 标准品

    注:标准品稀释液为蛋白样品的溶解液,原则上蛋白样品的基质溶液应与稀释液保持一直,也可用 0.9%的 NaCl 或 0.01M PBS 进行稀释。先将标准品稀释至 2mg/ml(操作如:120ul BSA(5mg/ml)+180ul 稀释液
    =300ul BSA 溶液(2mg/ml)
    BSA 标准品配制可参考下表(微孔板检测,线性范围 20-2000ug/ml)

    BSA 标准品配制可参考下表(试管法检测,线性范围 20-2000ug/ml


  2. 配制 BCA 工作液

    (1)配制 BCA 工作液
            按照 50:1 的比例混合试剂 A 和试剂 B(A:50,B:1),充分混匀

    (2)计算所需要的总 BCA 工作液体积
            BCA 工作液体积=(标准品+待测样品)*重复孔数*每个样品所需 BCA 体积注意事项:试管法检测时每个样品加 2.0ml BCA 工作液,微孔板检测每个样品加 200ul BCA 工作液。

实验步骤:

试管法(样品:BCA 工作液=1:20)

  1. 各取 100ul 标准品梯度溶液和待测样品加入到反应管中;

  2. 每管加入 2.0ml 的 BCA 工作液,混匀,37°C孵育 30 分钟;

    注意:也可室温孵育 2 小时,或 60°C孵育 30 分钟。BCA 检测蛋白浓度,延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限,以及降低工作线性范围。


  3. 冷却至室温,在分光光度计上进行检测,设定波长为 562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。然后在 10 分钟内完成对所有样品的判读。

    注意:由于 BCA 反应无真正的反应终点,即时温度下降低至室温,生色反应还是会继续。但是,由于室温下生色比率相对很低,因此若是 10 分钟内能对所有样品进行 562nm 的吸光度测试,不会导致明显误差。


  4. 根据 BSA 标准品的吸光度(减去标准品中 0 值的 OD 值即为最终的读数),绘制标准曲线(蛋白浓度 ug/ml,为 x 值;吸光度 OD562nm 为 Y 值),依据标准曲线和样品的稀释倍数计算出样品中蛋白浓度。

微孔板法(样品:BCA 工作液=1:10)

  1. 如表,将 BSA 标准品(2mg/ml)添加入微孔板中,再用稀释液补足至 20ul;

  2. 取 20ul 样品加入反应孔中(建议未知样品,利用稀释液稀释几个梯度);

  3. 将 BCA 工作液按照 200ul 孔加入各个反应孔中,封膜,放置合适环境进行反应(37°C或 60°C反应 30min;室温反应 2h)

  4. 冷却至室温,在酶标仪的 540~595nm 波长范围内检测吸光度,其中562nm 波长最佳;

  5. 根据 BSA 标准品的吸光度(减去标准品中 Blank 孔的 OD 值即为最终的读数)。绘制标准曲线(蛋白浓度 ug/ml,为 x 值;吸光度 OD562nm 为 Y 值),依据标准曲线和样品的稀释倍数计算出样品中蛋白浓度。

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