在PCR实验中使用适当的聚合酶将确保最佳的产量和特异性，但市场上有那么多种聚合酶，如何选择，有时还真是个难题。厂家一般都会提供一个选择指南，列出每个产品的特异性、保真度、产量等。保真度是实验成功最关键的因素之一，不可不重视。

什么是聚合酶保真度？

DNA聚合酶的保真度是指准确复制目的模板的结果。具体来说，这涉及到多个步骤，包括读取模板链，选择正确的三磷酸核苷，并将此核苷酸插入3’引物末端的能力。为了高效区分正确和错误的核苷酸，一些DNA聚合酶具有3’到5’核酸外切酶活性。这种“校正”活性可切除不正确掺入的单核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸。高保真PCR使用掺入错误率低且具有校正活性的DNA聚合酶，以保证目的DNA的忠实复制。

保真度在何时很重要？

在设计PCR实验时，你首先要考虑你的应用是否需要高保真聚合酶。如果实验结果依赖于正确的DNA序列（如克隆或测序），那么你就要尽量减少错配核苷酸的掺入。而对于普通PCR或菌落PCR，确定扩增子是否存在或质粒上是否带有插入片段，那高保真则大可不必。由于某些高保真聚合酶的强劲特性，一些研究人员在所有扩增中都使用它们。

如何测定保真度？

厂家通过各种不同的方法来确定DNA聚合酶的保真度。Thomas Kunkel曾介绍过一种方法，使用M13噬菌体的部分lacZα基因，通过宿主菌落颜色的变化来检查DNA合成中的错误。以Kunkel的分析为基础，Wayne Barnes则开发出一种分析，利用PCR来复制整个lacZ基因和两个抗药性基因的一部分，随后连接、克隆、转化和蓝白斑筛选。若lacZ基因存在错误，则破坏β-半乳糖苷酶活性，导致白斑的出现。通过这些实验方法，白斑克隆的比例可转化为错误掺入的数量。Sanger测序则提供了保真度的更直接读取，可检测所有突变。利用这种方法可确定聚合酶的整个突变谱。

何为高保真？

关于DNA聚合酶的高保真，目前还没有统一的定义。人们往往与Taq DNA聚合酶比较，来判断保真度的相对高低。例如，NEB（New England Biolabs）的科学家测定Taq聚合酶的错误率为2.7x10^-4 ± 0.8x10^-4，或每3700个碱基1个错误。这些数据表明，利用Taq以25个PCR循环扩增400 bp的片段，可能一半的克隆都带有错误。对于较大的片段如1 kb，每个克隆都可能带有不想要的突变。相比之下，NEB的Q5超保真聚合酶的错误率比Taq低100倍。根据这一数据，200个克隆中的199个将是正确的。

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