人游离DNA(cfDNA)ELISA试剂盒

使用目的： 本产品 适用于体外定量检测血清、血浆或细胞培养上清液、组 织等中天然和重组的 cfDNA 浓度。

实验原理：钰博生物生产的 ELISA 试剂盒采用“夹心法”:将捕 获人 cfDNA 抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中 的靶蛋白，生物素化的检测抗体与靶蛋白结合， SABC 复合物与生物素化检测抗体结合，形成免疫复合物，加 入 TMB 显色液后，若反应孔中有靶蛋白则显蓝色，加 入终止液变黄色，检测过程中游离的成分均被洗去，用 酶标仪在 450 nm 处测 OD 值，靶蛋白浓度与 OD 值之间 呈正比，通过绘制标准曲线计算出标本中靶蛋白的浓度。

试剂盒参数： 检测范围：1.563 ~ 100 ng/mL

标本收集与试剂准备: 

样品预处理：下面列出的样品收集和储存条件旨在作为一般 性指导。样品稳定性尚未评估。

细胞培养上清液： 在1000×g下离心15分钟去除颗粒，立即进行测 定或等分装样品，并将样品储存在≤-20℃的温度下。 避免重复冻融循环。（细胞培养上清液样品建议2倍 稀释。例如：100μL样品+100μL的1×稀释液） 

血清： 使用血清分离管，使样品在室温下凝结30分钟， 然后在1000×g下离心15分钟。立即取出血清并进行 测定或等分装样品，将样品储存在≤-20℃的温度下。 避免重复冻融循环。（血清样品建议2倍稀释。例如： 50μL样品+50μL的1×稀释液） 

血浆： 使用EDTA或肝素作为抗凝剂收集血浆。收集后30 分钟内，以1000×g离心15分钟。立即测定或等分装样品，并将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复 冻融循环。（血浆样品建议2倍稀释。例如：50μL 样品+50μL的1×稀释液） 注：柠檬酸盐抗凝剂血浆未经验证可用于本试验，使 用时应自行验证可行性。溶血的样品不适合用于该测 定。

组织匀浆： 用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残 留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响检测结果），称 重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一 般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL 的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好 记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀 浆器中，于冰上充分研磨或匀浆机研磨。为了进一步 裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复 冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5-10分钟，取上清检测。

细胞裂解液： 贴壁细胞用预冷PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶 消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直 接离心收集。收集的细胞用预冷PBS清洗3次，每1× 106个细胞中加入150-200μL的PBS重悬（推荐在PBS 中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可适当减少PBS体 积）并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于 2-8℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。

1. 其它样本类型：1000×g 离心 20 分钟，取上清 即可检测。

2. 洗涤液配置：用蒸馏水 1:20 稀释（例：1ml 浓 缩洗涤液加入 19ml 的蒸馏水） 

3. 标准品配制：取 8 个 1.5ml 离心管，分别标注 S1,S2,S3,S4,S5,S6，S7，blank，第一管 S1(100ul)中加入标准品/样品稀释液 900ul，第二至第八管中分别加入标准品/样品稀释液 200ul，在第一管中加入标准品溶液 （1000ng/ml ）100ul 置于漩涡混合器上混匀后 用加样器吸出 200ul，移至第二管，如此反复作 对倍稀释至 S7，第八管为空白对照。配置好的 标准曲线浓度为: 100、50、25、12.5、6.25、 3.12、1.56、0 ng/ml（标准品的用量及标准曲 线范围也可根据自己需要配置）。 

4. 生物素化抗体工作液配置:使用前 20 分钟，用生 物素化抗体稀释液将 100×生物素化抗体稀释 成 1×工作液，根据所需用量配置，当日使用， 剩余弃之。

5. SABC 工作液配置:使用前 20 分钟，用 SABC 稀释 液将 100×SABC 稀释成 1×工作液，根据所需用 量配置，当日使用，剩余弃之。

6. 如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最 高值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍 数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。 

检测程序:

1. 加样：空白孔加入 100μl 标准品/样品稀释液， 其余孔各加入标准品或待测样品 100ul，将反应 板混匀后置 37℃，60 分钟。

2. 洗板：用 1×洗涤液将反应板充分洗涤 3 次，每 孔加入 1×洗液 300μl，每次震荡/浸泡 1-2 分 钟，向滤纸上印干。 

3. 空白孔加入 100ul 生物素化抗体稀释液，其余孔 各加入 1×的生物素化抗体工作液 100ul，混匀 后置 37℃，60 分钟。

4. 洗板：同上。 

5. 每孔加入 SABC 工作液 100ul，混匀后置 37℃， 30 分钟。 

6. 洗板：同上。 

7. 每孔加入 TMB 显色底物 100ul，混匀后置 37 ℃ 暗处反应 10-20 分钟（具体显色时间根据显色结 果而定）。 

8. 每孔加入 50ul 终止液，混匀，5 分钟内用酶标 仪在 450nm 处测吸光值。 

结果判断与计算：

1. 所有 OD 值建议减除空白孔值后再进行计算，如空 白孔 OD 低于 0.1，也可以直接计算。

2. 以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，手工绘 制或用软件绘制标准曲线，根据样品 OD 值计算出 相应含量，再乘以稀释倍数即可。