植物乳植杆菌核酸检测试剂盒(荧光PCR探针法)

【产品名称】 植物乳植杆菌核酸检测试剂盒(荧光PCR探针法)

【包装规格】 50T/盒

【货号】 YB-72597NPR

【产品简介】

植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum，旧名 Lactobacillus plantarum）是一种 广泛分布于自然界的革兰氏阳性乳酸菌，属于乳杆菌科（Lactobacillaceae）。其生境极 为广泛，主要存在于多种发酵性植物性食品（如泡菜、酸菜、发酵豆制品等）、乳制品、 动物肠道以及某些发酵肉制品中。

植物乳植杆菌具备良好的环境适应性，能在较广的 pH 和温度范围内生长，并能耐受一 定的盐分和胃肠道环境，是一种重要的益生菌。该菌株能够调节肠道微生态平衡，促进有 益菌增殖，抑制有害菌的生长，有助于维护肠道健康；还能增强宿主免疫力，参与抗氧化 反应，降低胆固醇水平，改善乳糖不耐受症状，预防和缓解腹泻以及控制部分过敏反应。 部分株系甚至可产生具备抗菌活性的物质（如植菌素），用于食品防腐和安全保障。此外， 植物乳植杆菌具有较强的发酵能力，能够高效发酵多种碳水化合物，并产生较多的乳酸， 从而显著改善食品的风味和品质。由于其安全性高、毒性低、耐受性强等优点，被国际食 品安全组织（如 EFSA、FDA）认可为“安全菌株”，广泛应用于功能性食品及动物饲料添 加剂等多个领域。

【试剂组成】

注意：高浓度标准品用于制备绝对定量的标准曲线，但易污染检测样本，需要在远离样本的区域用带滤芯的枪头先稀释成10³ copies/μL，方可作为阳性对照使用。

【储存条件及有效期】

-20℃, 避光保存、运输、反复冻融少于7次，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR检测仪。

【样本采集及存放】

1 样本采集

1.1 工具

棉拭子、一次性无菌注射器、剪刀、镊子、研钵、1.5 mL离心管、移液器吸头、药匙。所有上述取样工具应经121℃，15min高压灭菌并烘干；1.5 mL 离心管、吸头应无DNA酶污染。

1.2 采样方法

拭子样品：鼻拭子采样，采样时要将灭菌处理过的拭子深入鼻腔来回刮3次~5次，取鼻腔分泌液。

肛门拭子：将灭菌处理过的拭子深入肛门转一圈蘸取粪便。粪便采样用高压过的药匙取新鲜的粪便，往往为稀便或血便。组织样品：组织样品采集时应采取有明显病变组织，编号备用。

2 存放与运送

采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用样品箱加冰密封，尽快运送到实验室。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 RNA提取

1 核酸提取请参照相关商品RNA提取试剂盒说明书进行操作即可。

2. 稀释标准曲线样品（以1E2-1E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

由于标准品浓度非常高， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。

2.1 标记5个离心管，分别为6，5，4，3，2。

2.2 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同。

2.3 在6号管中加入5 μL1E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，吹打混匀，得1E6拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。

2.4 换枪头，在5号管中加入5 μL1E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，吹打混匀，得1E5拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。

2.5 换枪头，在4号管中加入5 μL1E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，吹打混匀，得1E4拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。

2.6 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品，放冰上待用。

若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到1E5拷贝/μL即可。

3. Probe RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行，冰上操作）

3.1 从-20℃以下冰箱中取出试剂盒，在室温融化后置于冰上。待完全溶解后上下颠倒轻轻混匀（请不要使用振荡器进行混匀），尽量避免出现泡沫并低速离心10s。

3.2 根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份），每测试反应体系配制如下表：

根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装18 μL反应混合液，盖上管盖后将PCR反应管转移至样本处理区。

3.3 加样（在样本处理区进行）

将制备的核酸样本、阳性对照（105 copies/μL）各取2 μL分别加入PCR管中，盖好管盖，低速离心30秒后立即进行PCR扩增反应。

注意：每孔反应液中RNA模板量小于200 ng。

将 PCR 反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-20℃以下冰箱冷冻保存。

4. 上机检测（在检测区进行）

将PCR反应管放入荧光PCR检测仪内，按照下表设置核酸扩增相关参数，选择ROX荧光通道。

推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果判断

当同时满足以下条件时可判定试验成立，否则试验无效：

阳性对照：FAM通道Ct值≤35；

阴性对照：FAM通道无Ct值或Ct值＞35。

5.2 检测结果

(1) 进行定量检测时，需以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA拷贝数浓度的log值，再推算出其拷贝数浓度。

(2) 进行定性检测时：Ct值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出牛病毒性腹泻病毒，结果为阳性；Ct值>40或无Ct值，表明样本中未检测出牛病毒性腹泻病毒，结果为阴性；Ct值在38-40范围，应对样本进行复检，如重复实验结果Ct值仍在38-40范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

【注意事项】

所有操作严格按照说明书进行；

试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

加样时应使样品落入反应液中，不应有样品黏附于管壁上，加样后应尽快压紧管盖；

反应液应避光保存；

反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行， 以免交叉污染；

实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【检测方法的局限性】

样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

本产品仅供科研使用。不能用于人和动物治疗等其它临床诊断使用！