猪心脏瓣膜内皮细胞

原代细胞传代方法：

一、贴壁细胞的消化法传代

1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。

2、加入1ml左右消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使瓶底细胞都浸入溶液中。

3、消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时，弃去消化液，加入培养液终止消化。

4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

二、悬浮细胞的传代

1、直接传代

1）让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3。

2）用吸管吹打形成细胞悬液后，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。

2、离心法传代

1）将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心800-1000rpm，5分钟。

2）去除上清，加新的培养液一离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液。

3）将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。

原代细胞培养中的6个常见错误

错误＃1：一小管原代细胞在水浴中解冻一段时间

纠正＃1：原代细胞对解冻过程非常敏感，因此将小瓶置于37℃水浴中，保持并轻轻旋转直到内容物刚刚解冻是很重要的。然后应立即从水浴中取出小瓶，并转移到无菌操作台。确保您的培养瓶在解冻前已经准备就绪，以便可以立即用于接种细胞，并置于培养箱中。

错误＃2：解冻小瓶后直接离心原代细胞

纠正＃2：我们不建议在解冻后离心细胞，因为离心程序比少量的DMSO残留更有害。记住，在恢复原代细胞后的第二天更换培养基以去除任何残留的DMSO。

错误＃3：允许原代细胞变得过于融合

纠正＃3：当生长至100％汇合时，原代细胞可以变得衰老。记住，原代细胞不是100％纯，因此重要的是尽量减少污染细胞的生长。我们建议在细胞达到90-95％融合时，对原代细胞进行传代培养。

错误＃4：传代原代细胞时过度胰蛋白酶消化

纠正＃4：当细胞传代时，使用低浓度的胰蛋白酶并在显微镜下密切监测细胞。此外，记得在胰蛋白酶消化后完全中和细胞中的胰酶，因为任何活性的胰蛋白酶都将损伤细胞。我们特别推荐专门为原代细胞配制的胰蛋白酶中和溶液，但也可以使用10％血清或大豆胰蛋白酶抑制剂。

错误＃5：原代细胞可以很容易地重新冻存

纠正＃5：通常我们不推荐重新冻存原代细胞，因为这可以促进细胞衰老和/或导致功能变化。原代细胞非常敏感，重新冻结可能导致细胞死亡或损伤。

错误6：原代细胞可以无限的增殖

纠正＃6：与细胞系不同，原代细胞具有有限的扩增能力。我们建议尽早使用原代细胞进行实验以防止遗传漂移。此外，如果你正在使用一个增值困难的细胞类型，你应该密切监测细胞形态，因为少量混杂的细胞（如成纤维细胞）可能随着时间的推移，大量生长从而成为主要细胞。