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Bst 5.1 IsoAmp MasterMix
| LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的滚环扩增技术,在恒温条件下，呈指数级别放大核酸分子，30分钟内将DNA放大109~1010倍。其快速、恒温的独特技术优势，使得LAMP技术成为开发诊断试剂的明星潜力技术。由于在LAMP扩增中用到很高浓度的引物，因此难免保证有少量错配和引物Dimer，这些轻微的污染都会导致LAMP高速的扩增中造成假阳性检测。无论采用SYBR Green、浊度、HNB等各种显色方法都很难产生高特异性的信号。因此从公布至今有近20年的时间，其仍然无法在诊断试剂领域获得广泛应用。因此，将类似标准定量PCR中的TaqMan探针技术应用到LAMP检测中，一直是分子生物家追求的目标。至今，虽有多种探针设计方案，但均无法满足准确、可靠、快速的要求。 2019年，HaiGene在开发非洲猪瘟快检试剂的实验过程中，研发出了具有链置换活性和探针切割活性的DNA聚合酶-Bst 5.0，并将该酶成功用于环介导的恒温扩增反应和TaqMan探针组成的荧光检测系统上。2020年HaiGene进一步将该酶升级为Bst 5.1 DNA聚合酶，并采用了创新的P-Bond探针技术（一种探针锚定技术，专用于置换扩增的探针技术），大幅度提高了LAMP扩增中探针切割的效率和切割稳定性，使得荧光信噪比获得极大提升。应用该项技术后，在利用恒温扩增快速、高灵敏度、恒温检测优点的基础上，彻底解决了LAMP技术的假阳性问题。将TaqMan探针应用于LAMP扩增体系后，为LAMP技术更加广泛的应用于临床诊断奠定了坚实的基础。HaiGene将此项技术命名为：探针辅助恒温荧光检测技术（PA-L-Amp，Probe-assisted Loop mediated Isothermal Amplification）。 注：本产品为定制开发型产品，具体信息请来电或邮件咨询。如需订购，请发送基因序列信息至order@haigene.cn, 我公司负责引物和探针的制备。 | ||
主要特征 | ||
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探针辅助恒温荧光检测与TaqMan PCR的原理比较 | ||
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探针辅助恒温荧光检测技术与TaqMan PCR的差异比较 | ||
| TaqMan PCR法探针辅助恒温荧光法扩增条件95-60℃循环变性、复性扩增60℃恒温滚环扩增引物靶标区域3个特异性区域9个特异性区域信号放大级别倍数级（增加2倍/循环）指数级（增加107倍/min）探针形式双标记切割探针双标记切割探针报告基团荧光基团，通常FAM荧光基团，通常FAM反应时间35~60min15~25min是否可采用粗制核酸全血或溶血样品必须提取核酸所有样品可直接使用所需的设备标准定量PCR仪可以使用标准定量PCR仪 也可以使用便携式恒温荧光仪是否可野外操作否可以敏感度>50 Copy易判读单Copy易判读特异性偶有假阳性无假阳性 | ||
恒温荧光探针法检测技术引物和探针设计原则 | ||
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| 1. 扩增产物大小在160-300bp，即F2与B2区段大小。F1C和B1C的区段间隔通常在40-80bp，便于放置特异性P-Bond荧光探针。P-Bond荧光探针长度保持在22-30bp，TM值在58-65℃。探针与F1C（或B1C）的3’端间隔大于4bp，尽可能大于6bp。 2. 关于多重PA-LAMP的使用，由于环扩增速度极快，通常在3-5min内即可达到扩增平台期，并将底物消耗掉。在多靶病原的检测中，由于不同病原（靶基因）含量不尽相同，因此当一个病原（靶基因）获得扩增后，另一个无法再扩增，导致灵敏度会大幅下降。因此多重PA-LAMP反应建议应用于内参质控，或高变异的RNA病毒中的防脱靶检测中。具体情况可参考我处开发的双重非洲猪瘟病毒检测试剂盒和三重新冠病毒检测试剂盒的检测模式。 3. 目前还没有相关配套软件来设计引物探针组，除此外，为了确保LAMP的反应速度, Bst 5.1 DNA聚合酶仍然具有极强的链置换活性，因此虽然应用了P-Bond技术，但在实际开发中，仍然有部分探针存在切割效率低的情况，还无法保证每一条P-Bond探针100%工作。HaiGene除了提供全套试剂盒开发服务外，也全力免费对外提供引物和探针的设计技术支持，便于客户自行试剂盒的研发工作。 | ||
探针辅助恒温荧光检测技术与TaqMan PCR的敏感性和特异性比较 | ||
| 以非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）外膜蛋白P72为靶基因（GenBank No.:AY578706）为例, 分别应用探针辅助恒温荧光检测技术和TaqMan qPCR法检测相同模板（标准质粒和病样），对其检测结果进行比较如下。 | ||
| 1、采用标准质粒进行灵敏度测试 | ||
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| 结果显示TaqMan PCR法在100 copy以上是容易判读的，在10 copy以下并不容易判读；而探针辅助恒温荧光法在5 copy的情况下仍然扩增有力，可以清晰判读。这得益于LAMP 107/min的复制能力，从扩增曲线可得知，在起峰后2~3min内，信号即可达到平台期，而且总体反应时间<20min，15min即可判读结果。 | ||
| 2、采用制备的病料DNA基因组进行灵敏度测试 | ||
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| 将病料基因组DNA做梯度稀释进行测试，结果显示TaqMan PCR法在pg级（25~50 copy）以上是容易判读；而探针辅助恒温荧光检测法在fg水平的情况下仍然可以清晰判读。从结果来看128fg的基因组DNA中含有单copy的病毒分子。 | ||
| 3、对低浓度模板的检测稳定性比较 | ||
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| 结果显示TaqMan PCR法在5到10 copy的模板量条件下（8重复实验），判读较困难。而探针辅助恒温荧光法在2 copy模板的条件下仍然清晰且稳定地判读（8重复实验）。 | ||
| 4、探针辅助恒温荧光检测法在便携式恒温荧光检测仪上的表现 | ||
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| 结果显示：在小型便携式恒温荧光检测仪上，探针辅助恒温荧光检测法同样表现出色。其表现出来的敏感性、特异性、稳定性、结果的可靠性，远远超出任何其它恒温检测技术。 | ||
| 5、探针辅助恒温荧光检测技术对于低病毒含量粗制样品的检测较TaqMan qPCR效果更佳 | ||
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| 结果显示：对于病毒含量极低的样品采用粗制品检测，探针辅助恒温荧光检测方法检测的4个样品扩增有力，结果更加清晰可判，因此探针辅助恒温荧光检测法方法完全符合低病毒含量样本粗制品的检测要求。 | ||
| 6、三重新冠病毒检测，目的基因为FAM通道（红色），内参基因beta-actin为ROX通道（蓝色），典型扩增曲线如下图： | ||
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| 7、两重非洲猪瘟病毒检测，典型扩增曲线如下图： | ||
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